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Semaphorin 5A基因:恶性黑素瘤的下一个治疗靶点?

2017-04-09 来源:网络 编辑:虎哥

  Semaphorin5A基因是Semaphorins家族成员,最初发现与中枢神经系统相关,之后发现其与肿瘤的侵袭转移相关。而黑素瘤的黑素细胞来源于神经嵴,早期已在黑素瘤细胞系A2058中检测到Semaphorin5A的表达,但该基因的表达是否影响黑素瘤细胞增殖和侵袭转移,还未证实。张莉等探讨了慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默神经导向分子5A(Semaphorin5A)基因对恶性黑素瘤A375细胞系生物活性的影响。

  针对Semaphorin5A设计2对shRNA引物及1对阴性对照引物,构建慢病毒载体,转染至人胚肾上皮HEK293T细胞系收获慢病毒,利用慢病毒感染A-375细胞系并通过嘌呤霉素筛选,成功获得稳定转染细胞系,实验分为实验组细胞(A375-shRNA1和A375-shRNA2)、阴性对照组细胞(A375-con)及空白对照组细胞(A375)。通过反转录PCR(RT-PCR)、Western印迹比较实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞Semaphorin5AmRNA、蛋白表达水平的差异。噻唑蓝(MTT)检测细胞生长情况;侵袭试验及划痕试验比较转染前后细胞的侵袭运动能力。

  结果显示

  Semaphorin5A成功转染A375细胞后,经嘌呤霉素筛选,成功获得稳定转染实验组A375-shRNA2细胞系及对照组A375-con。反转录PCR及Western印迹检测,干扰后实验组A375-shRNA2较对照组A375-con、A375Semaphorin5A的转录水平及蛋白表达水平表达下调。MTT实验结果显示,A375-con与A375细胞生长差异无统计学意义,A375-shRNA2细胞生长明显减慢,与A375和A375-con比较,差异均有统计学意义。划痕实验结果显示,A375-shRNA2划痕处细胞无明显迁移,划痕未得到修复,而A375及A375-con划痕处细胞最终几乎将划痕覆盖。侵袭实验结果显示,A375组与A375-con组穿过的细胞数差异无统计学意义;而A375-shRNA2通过小室的细胞明显少于A375及A375-con组,差异有统计学意义。

  同等培养条件下,慢病毒感染A37572h后细胞生长状态(×100)

  本研究提示慢病毒介导shRNA沉默Semaphorin5A基因能使A375细胞中的Semaphorin5A有效下调,并抑制细胞的生长,降低细胞的侵袭以及运动能力。