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人GJB6基因Tet-on HaCaT细胞稳定株的构建与鉴定

2017-04-11 来源:网络 编辑:虎哥

      目的

  以Tet-on慢病毒为载体建立稳定表达GJB6基因及其突变体的HaCaT细胞株,为后续研究有汗性外胚层发育不良的发病机制奠定实验基础。

  方法

  利用PCR技术扩增人GJB6基因野生型与突变型(A88V)基因,重组Tet-on慢病毒质粒,经基因测序及酶切技术对其鉴定,再将重组慢病毒转染入HaCaT细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定表达编码缝隙连接蛋白Cx30的GJB6基因的细胞株。细胞株加四环素诱导后,通过RT-PCR检测GJB6基因的mRNA表达量,同时通过Western印迹检测Cx30与FLAG标签肽的表达,从而对稳定表达GJB6基因的HaCaT细胞株进行鉴定。用CCK8法检测GJB6基因野生型与突变型经四环素诱导表达后对细胞增殖的影响。

  结果

  经酶切、测序鉴定,重组慢病毒质粒构建成功。RT-PCR检测到稳定转染的HaCaT细胞中GJB6基因mRNA表达量明显增加,感染野生型Tet-on慢病毒的HaCaT细胞组(WT组)加四环素GJB6基因表达丰度是WT组不加四环素的113.369倍(P<0.05),感染突变型(A88V)Tet-on慢病毒的HaCaT细胞组(MU组)加四环素GJB6基因表达丰度是MU组不加四环素的3.249倍(P<0.05);Western印迹可检测到经四环素处理的WT组和MU组稳定表达Cx30与FLAG,而未经四环素处理的细胞和感染阴性对照病毒的HaCaT细胞组(NC组)未检测到Cx30与FLAG目的条带。NC组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48h时的A值差异均无统计学意义(均P>0.05);WT组加与不加入四环素在4、8、12、24、36h时的A值差异均有统计学意义(均P<0.05);MU组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48h时的A值差异均有统计学意义(均P<0.05)。

  结论

  成功构建出稳定表达GJB6基因野生型及其突变体A88V的HaCaT细胞株。